擴增子測序是一種目標基因測序方法，它針對特定基因組區(qū)域進行PCR擴增和測序。什么是擴增子測序？它有什么用途？上海通蔚生物在下文詳細為大家介紹，使大家了解更多生物知識應用于科研。

  什么是擴增子測序？

  擴增子測序是一種靶向測序方法，使用寡核苷酸引物擴增基因組的特定區(qū)域。這種方法為研究人員提供了機會，使他們能夠僅獲取他們最關心的基因組代碼部分的遺傳信息。擴增子測序采用聚合酶鏈式反應(PCR)，這是分子生物學中最廣泛使用的技術之一。PCR包括在短時間內(nèi)創(chuàng)建特定核酸樣本的多個副本（這一過程稱為擴增）。

  擴增子測序是研究復雜自然和人工環(huán)境中的微生物多樣性、靶向病原體測序以追蹤傳播途徑和研究病原體進化以及變異識別的完美工具。

  擴增子測序有何用途？

  擴增子測序廣泛用于識別各種病原體并追蹤其進化和傳播模式。該技術在COVID-19大流行期間對追蹤和控制SARSCoV-2病毒的傳播做出了重大貢獻。擴增子還廣泛應用于各種分子生物學技術中，如DNA測序、基因組學、環(huán)境微生物學等。通過擴增特定的DNA序列，可以快速而精確地檢測和鑒定目標生物體或基因，從而在研究和診斷中起到重要的作用。

  什么是16SrRNA測序？

  16SrRNA測序是最流行的擴增子測序方法之一。它通常用于識別和比較給定樣本中細菌和古細菌的分類組成。這種強大且經(jīng)濟高效的非培養(yǎng)方法使科學家有機會識別使用更傳統(tǒng)的濕式實驗室技術時可能會被忽視的菌株。原核生物16SrRNA基因長約1500bp，包含9個可變區(qū)(V1-V2)，這些可變區(qū)由保守區(qū)隔開。對16SrRNA基因的這些可變區(qū)進行測序被廣泛用于復雜微生物群落的深度分類（在屬或有時甚至在物種級別）。此外，16SrRNA測序受益于擴增子測序的固有優(yōu)勢，包括能夠在一次測序運行中組合多個樣本（多重）。

  成功建立擴增子測序實驗的五個技巧：

  1.核酸樣本

  使用新鮮、高質(zhì)量的核酸模板。鑒于基于PCR的方法（包括擴增子測序）的分辨率非常高（這通常被認為是一種優(yōu)勢），使用降解或受污染的模板可能會導致不確定或有爭議的結果。

  2.主混合物和高標準引物設計

  使用市售的主混合物，而不要單獨混合所有成分[DNA聚合酶、核苷酸(dNTP)、特定離子(MgCl2)]。這有助于最大限度地減少人為錯誤以及樣本間差異，并提高一致性。

  3.污染

  擴增子測序的高分辨率意味著即使輸入模板量非常小，也會導致分析樣本中不存在的污染序列的擴增。這就是為什么PCR區(qū)域的所有表面都應定期用5%漂白劑溶液或紫外線消毒進行消毒。如果可能的話，請在無模板區(qū)域（最好是單獨的房間）準備PCR反應，然后在另一個房間添加核酸樣本。

  4.控制

  最大限度地減少污染可能性的最有效方法之一是在整個實驗過程中有效使用控制。

  a、陰性或無模板對照(NTC)對于確認沒有交叉污染尤為重要。NTC包括除核酸模板之外的所有試劑；通常用等量的無核酸酶水代替模板。

  b、陽性對照包含已知核酸序列和用于檢測該序列的引物。該對照用于識別假陰性結果。如果陽性對照產(chǎn)生信號，則表示PCR中的所有試劑均正常工作。陽性對照對于研究條形碼錯配的影響特別有用。

  5.條形碼不匹配

  由于現(xiàn)代NGS平臺會生成大量數(shù)據(jù)，因此通常會將多個文庫合并（或多路復用）并在一次運行中進行測序，以降低測序成本。為了能夠在測序后識別每個讀取，在文庫制備步驟中，使用樣本特定的DNA索引標記所有DNA片段（或進行條形碼編碼）。這種樣本多路復用有時會導致索引錯誤分配，原因是各種機制，包括索引跳躍或條形碼污染。因此，測序讀取可能會分配給錯誤的索引（從而分配給錯誤的樣本），并將從下游生物信息學分析中丟棄。為了最大限度地降低條形碼錯誤分配的風險，建議仔細選擇多路復用策略，以使用獨特的雙索引(UDI)適配器或索引引物。

  擴增子測序是一種高通量靶向測序方法，使研究人員有機會在一次運行中對多達數(shù)千個感興趣的基因區(qū)域進行測序。與非靶向方法相比，這種高度針對性的方法具有成本效益，并且周轉時間更短。